Science新突破：张峰团队开发出新一代RNA单碱基编辑器！这次会更安全吗?丨医麦猛爆料

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2019年7月13日/医麦客 eMedClub/---2019年7月11日，基因编辑先驱张锋及其团队在Science 在线发表题为“A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing”的研究论文，介绍了基于CRISPR系统开发出的一种新型RNA单碱基基因编辑工具（RESCUE）。该研究是通过定向蛋白进化将ADAR2转化为胞苷脱氨酶，改进后的ADAR2能够将胞嘧啶C转化为尿嘧啶U，称为特定C到U交换的RNA编辑。

两大单碱基基因编辑巨头

David Liu＆张峰

三年前的2016年4月，David Liu（刘如谦）等人在 Nature 发表论文，在 J. Keith Joung 研究的基础上首次开发出了CRISPR-Cas9单碱基编辑器（CBE），CBE（BE3.0）基于胞嘧啶脱氨酶APOBEC1（能催化C脱氨基变成U，而U在DNA复制过程中会被识别成T）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI（能防止尿嘧啶糖基化酶将U糖基化引起碱基切除修复）在不依赖DNA双链断裂的情况下首次实现了对单个碱基的定向修改。从此开启了CRISPR系统的单基因编辑时代，给基因编辑领域带来了巨大的惊喜，对众多单碱基遗传病来说具有绝对的优势。

▲David Liu（刘如谦）

2017年10月25日，该团队又开发了另一种单碱基基因编辑工具——腺嘌呤碱基编辑器 (ABE)发表在《Nature》上。它可以将A-T碱基对转换成G-C碱基对，加之CBE的将G-C碱基对转换成T-A 碱基对的成果，从此研究人员首次实现了不依赖于DNA断裂而能够将DNA四种碱基A、T、G、C进行替换的单碱基基因编辑技术。

而且在这项研究中，在人胚胎肾细胞和骨癌细胞中，该技术以约50％的效率和几乎没有可检测的副产物进行了研究人员所需要进行的校正。相比之下，更传统的基于CRISPR的方法，其中科学家插入含有所需碱基变化的DNA链，其效率小于5％并且经常引起在编辑过程中不希望出现的大块DNA的插入或缺失。之后，该团队也对ABE进行了多次优化和升级，成功改善了遗传性酪氨酸血症I型（HTI）。

然而在任何时候，对于人体DNA的改变都应当谨慎对待，尤其是可遗传的改变。并且，使用CRISPR / Cas9介导的DNA编辑难以编辑某些细胞类型，例如神经元，因此对于一些影响大脑的破坏性疾病，基于CRISPR的DNA编辑就有些无能为力了。

▲张锋

而就在同一天，张峰团队的CRISPR新系统“REPAIR”，一种RNA单碱基编辑器在国际学术期刊《Sience》上发表。“REPAIR”的基本元件是一种取名为PspCas13b的酶和ADAR2蛋白。与常见的Cas9不同，Cas13蛋白只靶向RNA，使得“REPAIR”可高效地修复RNA的单个核苷，不会改变DNA信息而更为安全，将为基础研究和临床治疗提供一个新的工具。

2017版的“REPAIR”是将RNA靶向CRISPR-Cas13（dCas13）与ADAR2的腺嘌呤脱氨酶结构域融合，然后利用dCas13将RNA编辑器的活性结构域ADAR2引导至特定的RNA转录物，特异性地将RNA上的腺嘌呤A转化为与鸟嘌呤G结构类似的肌苷I。在人类的疾病中，由鸟嘌呤（G）向腺嘌呤（A）的突变极为常见。类似的突变能在罹患局灶性癫痫（focal epilepsy）、杜氏肌营养不良、或是帕金森病的患者体内找到。因此，如果能逆转这一常见突变，把A矫正回G，就有望从根源上治疗这些疾病。当时的结果从概念上支持了这套系统的可行性。

▲一步简单反应，A to G（I）（来源Sience）

这一次，在“REPAIR”的基础上，张锋团队改进了RNA编辑器的活性结构域ADAR2，使其能执行C-to-U的单碱基编辑。与此同时，它原先将A转化为I的功能依旧得到了保留。这次RESCUE系统对编码APOE4的RNA进行了编辑。APOE4与阿尔茨海默病有关，是疾病的风险因子。有趣的是，另一种和它很接近的蛋白APOE2却相对比较无害，而两者仅有非常微小的区别。通过RESCUE系统，他们成功地将APOE4 RNA分子中的2个字母从C变成了U，将风险因子转变成了无害蛋白！随后，研究人员们进一步对其进行了优化，减少其脱靶效应。

▲新型RNA编辑系统的原理（来源Sience）

人类的很多疾病信息都编码在DNA这个“生命脚本”上。基因编辑技术的出现使得科学家有了修改DNA的可能，给治愈疾病带来希望。但由于基因承载着生命最根源的信息，对DNA进行编辑有着安全和伦理上的顾虑，RNA编辑则提供了另一种可避免对基因组进行永久性改变的选择。Zhang和Liu都强调，基础编辑治疗进入临床试验之前可能需要几年时间，还需要明确该方法是否具有优于现有基因治疗的优势。

脱靶问题---永恒的焦点

不可否认，CRISPR系统自问世以来，彻底改变了人类对基因进行编辑和调控的方式。基于CRISPR系统，通过利用不同的酶（编辑DNA的Cas9或Cas12蛋白，编辑RNA的Cas13蛋白），这一系统的应用范围已扩大到RNA。通过科学家们的努力，其编辑方式也从传统的片段式切割发展至现在的单碱基基因编辑，但是CRISPR系统每次的技术革新都有一个共同的关注点---在应用时到底有没有存在明显的脱靶问题。这是CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最终走上临床的关键，也是一直以来关于基因编辑技术争论的焦点。

2019年3月1日，《Science》 杂志同期发表了两篇来自中国科学家的论文，分别来自中科院神经科学研究所杨辉研究团队等与中科院遗传发育所高彩霞研究团队，两项研究分别在小鼠和水稻上证实，单碱基编辑系统存在严重的脱靶效应，同时会诱导大量的DNA突变。他们发现设计良好的CRISPR/Cas9以及单碱基基因编辑系统ABE没有明显的脱靶效应。与此相反的是，CBE系统可在小鼠胚胎以及水稻中导致大量的的脱靶性单核苷酸突变出现。

而在2019年4月18日，《Nature》杂志在线发表了一项来自麻省总医院病理学教授J. Keith Joung 领导的题为Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors的研究论文，该论文显示：单碱基编辑的脱靶效应比想象中还要严重，它不仅会导致DNA突变，还会导致大量RNA突变。CBE和ABE这两种重要的DNA单碱基编辑器均存在大量的RNA脱靶，并且利用点突变的方法筛选到一个CBE的突变体可以降低RNA的脱靶。

紧接着在5月8日，David Liu团队的在Science Advances杂志报道了题为Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors的研究，该文章中报道了一种ABE的突变体ABEmaxAW能够降低RNA的脱靶数量，同时保持DNA的编辑活性，但是值得注意的是，该突变体并未将RNA脱靶降低至对照组的水平，同时DNA的编辑的效率也有所下降。Keith Joung组最近投在BioRxiv上的文章也指出，将rAPOBEC1替换成单链DNA脱氨酶AID而不需要做任何的点突，就可以避免在RNA水平上的脱靶。目前对优化的CBE系统的on-target检测，数量还偏少，需要今后进一步增加样本量来验证其普适性。

并且在6月10日杨辉研究组在《Nature》发表题为"Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis"的研究论文。该研究也发现DNA单碱基编辑工具CBE和ABE均存在大量的RNA脱靶效应，相比于仅有GFP处理的对照组，CBE或ABE处理的细胞的RNA SNV平均增加了15倍之多。研究者通过一系列分析证明这些RNA脱靶产生的单核苷酸突变与目的编辑位点没有序列相似性，而主要是由于DNA单碱基编辑器的脱氨酶APOBEC1 (BE3.0)和TadA (ABE)所导致的。此外，团队还发现很高比例的RNA脱靶发生在癌基因和抑癌基因上，如果用于临床治疗有较大的致癌风险。

结  语

科学家们都表示，这些争论并不是给单碱基基因编辑泼冷水，他们在发现问题的同时也在寻找优化的方案，例如开发了新型脱靶检测技术GOTI等，希望能推动 CRISPR技术的进一步完善。只有这样，单碱基基因编辑系统才能更加安全地应用于基础研究和临床治疗当中。此次升级优化归来的“REPAIR”在脱靶问题方面会不会有所革新，我们拭目以待！

参考出处：

https://www.fiercebiotech.com/research/crispr-pioneer-zhang-targets-brain-diseases-new-rna-editing-system，以及文中出现的文献

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